mRNA疫苗相關(guān)產(chǎn)品-起發(fā)生物

一、mRNA疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊：mRNA制備和脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封

mRNA疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊，可以類比為“原料藥"（mRNA）的生產(chǎn)和純化，以及“制劑"（利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封）階段。原料藥（mRNA）生產(chǎn)涉及DNA原液制備和mRNA原液的制備，mRNA原液的制備（體外轉(zhuǎn)錄），是整個mRNA工藝流程中核心的步驟，而原料主要是酶。

(一)mRNA疫苗的生產(chǎn)

mRNA疫苗生產(chǎn)可分為兩大塊，原料藥（mRNA）的生產(chǎn)以及制劑（利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封）階段。mRNA生產(chǎn)涉及DNA原液制備和mRNA原液的制備。所以mRNA疫苗的生產(chǎn)可分為三大階段，第一步DNA原液制備，第二步mRNA原液的制備，第三步是利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封。

第一步：DNA模板生產(chǎn)，主要是質(zhì)粒生產(chǎn)。編碼抗原的DNA模板生產(chǎn)，常用大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá)，最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒；

第二步：mRNA原液的制備轉(zhuǎn)錄，由DNA到mRNA。在無細(xì)胞的反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，通過T7、SP6或T3等RNA多聚酶作用，通過一步或者兩步法轉(zhuǎn)錄成為mRNA，同時加上5’的Cap及3’的PolyA尾巴，在進(jìn)一步使用DNA酶將殘留的DNA模板進(jìn)行消除；純化，使用離子交換等層析步驟進(jìn)一步將轉(zhuǎn)錄形成的mRNA進(jìn)行純化，進(jìn)行超濾濃縮形成原液；

第三步：制劑階段，利用脂質(zhì)微粒進(jìn)行包封。通過微流體泵精確地控制著mRNA原液和脂質(zhì)流速，將他們混合成脂質(zhì)納米粒LNP。最后則是成品的灌裝及質(zhì)量控制，貼簽形成終產(chǎn)品。

 二、mRNA合成過程所需原料

（一）國內(nèi)外mRNAxin冠疫苗的合成工藝

BioNTech/輝瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工藝如下：

1）BNT162b2–BioNTech/輝瑞

三核苷酸cap1類似物（（m27,3′-O）Gppp（m2'-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下，通過T7RNA聚合酶對DNA進(jìn)行純化和體外轉(zhuǎn)錄。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用一步法，帽子類似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。

2）mRNA-1273–Moderna

利用優(yōu)化的T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在體外合成了編碼序列優(yōu)化的mRNA，尿苷被N1-甲基假尿苷wan全取代。轉(zhuǎn)錄后，使用牛痘苗封蓋酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）和痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶（新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室）將Cap1結(jié)構(gòu)添加到5’端。通過oligodT親和純化純化mRNA，通過切向流過濾將緩沖液交換到pH為5.0的醋酸鈉中，無菌過濾，并在-20°C下冷凍，直到進(jìn)一步使用。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法，需要加帽酶的參與，甲基假尿苷取代尿苷。

3）ARCoV-艾博生物

該mRNA在體外使用T7RNA聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄從質(zhì)粒ABOP-028（GENEWIZ）的線性化DNA模板中產(chǎn)生，該質(zhì)粒編碼SARS-CoV-2的密碼子優(yōu)化RBD區(qū)域，并包含5’和3‘的未翻譯區(qū)域（UTR）和一條poly-a尾巴，以未修飾的NTP作為原料和T7聚合酶體外進(jìn)行mRNA的合成，使用了牛痘加帽系統(tǒng)（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)進(jìn)行加帽。

總結(jié)：轉(zhuǎn)錄采用兩步法，需要加帽酶的參與。

（二）mRNA制備過程原料

mRNA制備過程需要用到的主要原料包括質(zhì)粒DNA模板、一系列酶（主要為7種酶）以及底物核苷酸等;

1、模板DNA所需原料：質(zhì)粒

DNA模板生產(chǎn)，主要是質(zhì)粒的生產(chǎn)。編碼抗原的DNA模板，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌大規(guī)模體內(nèi)表達(dá)，最后提取和純化攜帶目的序列的質(zhì)粒，即得到DNA模板。目前質(zhì)粒的生產(chǎn)提取和純化工藝很成熟，可以自建生產(chǎn)線或者外包出去，例如輝瑞自建質(zhì)粒生產(chǎn)工廠，大部分mRNA企業(yè)外包，Moderna和國內(nèi)企業(yè)目前是外包。

制備mRNA質(zhì)粒的要求：質(zhì)粒用于制備mRNA，這類DNA本身不屬于API，DNA需要按照GMP規(guī)范進(jìn)行，GMP質(zhì)粒要求生產(chǎn)設(shè)備必須是專用的、符合GMP規(guī)范且配備潔凈間。

 2、mRNA體外轉(zhuǎn)錄所需原料：一系列酶+核苷酸底物

mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)需要一系列酶的參與：mRNAT7聚合酶、無機(jī)焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7種酶。

如下表：

2.1轉(zhuǎn)錄過程所需要的酶

RNA聚合酶體系：RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。

T3、T7和SP6RNA聚合酶分別對T3、T7和SP6噬菌體啟動子具有高度的特異性。將目的基因序列克隆到T7和SP6啟動子下游的多克隆位點(diǎn)中，以克隆的DNA為模板體外合成相應(yīng)的RNA。

T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）【78MRNA-1104】高度特異識別T7啟動子序列，以含有T7啟動子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以核甘酸（NTP）為底物，合成與啟動子下游的單鏈DNA互補(bǔ)的RNA。

無機(jī)焦磷酸酶【78MRNA-1109】：加入無機(jī)焦磷酸酶，增加RNA產(chǎn)量。無機(jī)焦磷酸酶（PPase）可催化無機(jī)焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽，可以為蛋白、RNA和DNA的生物合成反應(yīng)提供動力，促進(jìn)產(chǎn)物的生成。在工業(yè)化生產(chǎn)mRNA疫苗的時候會產(chǎn)生大量的無機(jī)焦磷酸鹽，為了保證mRNA疫苗高效生產(chǎn)，可以添加無機(jī)焦磷酸酶，可解除生成的無機(jī)焦磷酸鹽對反應(yīng)體系的抑制。

RNase抑制劑【78MRNA-1103/78DA10001】：防止RNA的降解。少量RNase在RNA制備過程中引入，會導(dǎo)致RNA的降解，污染可能通過實(shí)驗(yàn)過程中使用的槍頭、試管（離心管）和其他試劑引入。通常使用RNase抑制劑作為減少和控制此類污染物的預(yù)防措施。

RNase抑制劑能與RNaseA形成1:1復(fù)合體，抑制RNase活性，在mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程需要保持mRNA的穩(wěn)定性以保證疫苗高質(zhì)量的生產(chǎn)。

2、轉(zhuǎn)錄所需材料-核苷酸和修飾核苷酸

mRNA疫苗研發(fā)中常進(jìn)行假尿嘧啶化修飾，尿嘧啶修飾是zui豐富的RNA修飾，一般由尿苷的異構(gòu)化產(chǎn)生，mRNA的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能：改變密碼子、增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性和應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。

3、加帽和加尾：共轉(zhuǎn)錄加帽/模板加尾，轉(zhuǎn)錄后加帽/加尾

真核生物體內(nèi)會對轉(zhuǎn)錄形成的mRNA進(jìn)行加帽，即在mRNA的5’端添加一個甲基化的鳥苷酸帽子（m7GPPPN結(jié)構(gòu)），從而保護(hù)mRNA免遭核酸外切酶的攻擊以增加mRNA的穩(wěn)定性，并且協(xié)助mRNA與核糖體的結(jié)合以促進(jìn)翻譯起始。生物體內(nèi)的帽子結(jié)構(gòu)有cap0，cap1，cap2三種形式，牛痘病毒加帽酶能夠在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基轉(zhuǎn)移酶處理即可得到cap1帽子。

此外，5'帽子還參加mRNA前體的剪接，參與mRNA3'末端多聚腺苷酸化，保證mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定運(yùn)輸。

加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶

可以將7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端，大幅提高mRNA的穩(wěn)定性和啟動mRNA的翻譯。牛痘病毒加帽酶能夠在一小時之內(nèi)對mRNA進(jìn)行加帽，效率接近100%。

在mRNA疫苗研發(fā)生產(chǎn)過程中，mRNA加帽效率和加帽mRNA穩(wěn)定表達(dá)的效率對疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)有重大的影響。牛痘病毒加帽酶體系加帽的mRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)效率大于帽子類似物mRNA的表達(dá)效率。

加尾酶：Poly(A)聚合酶

Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次摻入到RNA的3末端，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能夠增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性、提高翻譯起始效率、引導(dǎo)mRNA出核。

主要用到的酶：

1）牛痘病毒加帽酶【78MRNA-1105】：

2）痘苗2′O-甲基轉(zhuǎn)移酶【78MRNA-1106】

3）Poly(A)聚合酶

加帽酶非常昂貴，如何替代加帽酶？

一步法合成mRNA疫苗產(chǎn)品的加帽可以在mRNA的體外轉(zhuǎn)錄過程中通過摻入“帽子序列"實(shí)現(xiàn)，這種加帽技術(shù)會將加帽序列反向加在mRNA上，在反應(yīng)體系中加入5’帽類似物，可以省一個加帽酶，以及減少純化步驟，一定程度上降低成本（尤其是節(jié)省了昂貴的加帽酶成本），但相對應(yīng)地，產(chǎn)量較之兩步法（加帽酶參與）減少，因?yàn)榧用泵傅募用毙矢摺?/span>

4、消除DNA模板：需要DNA酶【78MRNA-1110】

合成后的產(chǎn)物可能會有DNA殘留，在疫苗開發(fā)階段，殘留的去除是關(guān)鍵的步驟，以減少下游純化難度并增加產(chǎn)品的純度。需要用DNA酶（DNAase將殘留的DNA模板進(jìn)行消除，在mRNA疫苗生產(chǎn)的過程中對DNA的殘留控制非常嚴(yán)格格。

二、關(guān)于遞送系統(tǒng)（LNP）原料

mRNA分子量大、親水性強(qiáng)，但自身的單鏈結(jié)構(gòu)致使其極為不穩(wěn)定，易被降解，自身攜帶負(fù)電荷，穿過表面同為負(fù)電荷的細(xì)胞膜遞送是難題，所以需要特殊的修飾或包裹遞送系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)mRNA的胞內(nèi)表達(dá)，遞送技術(shù)是mRNA公司的核心專li技術(shù)。

脂質(zhì)納米顆粒（Lipidnanoparticle，LNP）是目前主流的遞送載體方式。由于其比較容易被抗原呈遞細(xì)胞吸收，因此最常被用于疫苗，目前三大mRNA疫苗ju頭企業(yè)，Moderna、CureVac和BioNTech xin冠疫苗均采用了LNP遞送技術(shù)。

此外還有陽離子脂質(zhì)復(fù)合物(lipoplex，LPX)、脂質(zhì)多聚復(fù)合物(lipopolyplex，LPP)、聚合物納米顆粒（Polymernanoparticles，PNP）、無機(jī)納米顆粒（Inorganicnanoparticles，INP）陽離子納米乳（Cationicnanoemulsion，CNE)，以及瑞博生物自主研發(fā)的GalNacN-乙酰半乳糖胺技術(shù)，能夠進(jìn)行肝臟的定點(diǎn)傳遞。

 （一）LNP為主流的遞送載體方式

zui廣泛應(yīng)用的LNP組成成分：聚乙二醇脂質(zhì)、膽固醇、合成磷脂、可電離陽離子脂質(zhì)、mRNA。目前上市的mRNA疫苗成分主要有以下5種：

1）mRNA；

2）陽離子脂質(zhì)，與帶負(fù)電的mRNA結(jié)合，LNP最關(guān)鍵的成分；

3）膽固醇，介導(dǎo)LNP內(nèi)吞，以及穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)（膽固醇有助于增加細(xì)胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩(wěn)定性）；

4）磷脂酰膽堿，輔助型脂質(zhì)，可以在內(nèi)吞時加快mRNA的釋放；

5）聚乙二醇化磷脂，延長代謝時間，提高LNP穩(wěn)定性。

 1、陽離子脂質(zhì)體：LNP最關(guān)鍵的成分，是LNP逃離內(nèi)體的關(guān)鍵成分

目前Moderna、輝瑞、BioNTech，Curevac，Acuitas，Genevant等公司都自行篩選或授權(quán)從其他公司購買的陽離子類脂質(zhì)分子作為主要遞送材料，每家公司材料具體結(jié)構(gòu)各不相同，但都屬于特定條件下戴正電荷的陽離子脂質(zhì)。

陽離子脂質(zhì)體開發(fā)，在遞送效率和細(xì)胞毒性之間平衡。可電離陽離子脂質(zhì)作用是LNP遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵，提高mRNA的體內(nèi)穩(wěn)定性，并幫助mRNA逃避溶酶體的降解。

在生產(chǎn)原液時，將mRNA和陽離子脂質(zhì)體在特定PH值下混合一起，則陰離子mRNA就會和陽離子脂質(zhì)體產(chǎn)生靜電吸引融合在一起，一旦LNP被細(xì)胞吸收，核內(nèi)體的低pH環(huán)境將會融合LNP，從而釋放mRNA進(jìn)入胞質(zhì)溶膠。

陽離子脂質(zhì)作為載體有著廣闊的應(yīng)用前景，一些陽離子脂質(zhì)會引起細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)的細(xì)胞毒性取決于其親水性頭基的結(jié)構(gòu)，含有季銨頭基的兩親分子比含有叔胺的兩親分子毒性更大。陽離子有細(xì)胞毒性，解決對人體的副反應(yīng)是關(guān)鍵，可電離陽離子脂質(zhì)是LNP技術(shù)的核心，也是專li保護(hù)的重點(diǎn)。

2、非陽離子脂質(zhì)：膽固醇，介導(dǎo)LNP內(nèi)吞，穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)

膽固醇有利于確保LNP的雙層結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)的流動性。中性脂質(zhì)（如各種磷脂）也是用于構(gòu)建LNP雙層結(jié)構(gòu)的，因?yàn)殛栯x子脂質(zhì)體的雙層結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。

3、PEG-lipid：

PEG修飾的脂質(zhì)體形成親水保護(hù)層，維持LNP空間的穩(wěn)定性，聚乙二醇在顆粒表面可屏蔽血漿蛋白等成分結(jié)合顆粒，以避免LNP顆粒在體內(nèi)被清除。

PEG-脂質(zhì)結(jié)合物也可能引起不期望的毒性，含有PEG的LNP已知脂質(zhì)結(jié)合物與免疫細(xì)胞相互作用，產(chǎn)生針對某些聚乙二醇化脂質(zhì)的不希望出現(xiàn)的抗體。

4、磷脂酰膽堿，輔助型脂質(zhì)，可以在內(nèi)吞時加快mRNA的釋放。

5、其他賦形劑：有利于穩(wěn)定pH、溫度等。

（二）LNP遞送系統(tǒng)專li壁壘

LNP遞送系統(tǒng)的核心壁壘其實(shí)是材料的專li。Arbutus公司在2009年持有的US8058069號專li和2015年在中國申請的CN1021192178專li對于核酸和陽離子脂質(zhì)混合物進(jìn)行了非常全面的保護(hù)，對于幾乎所有陽離子脂質(zhì)和核酸和混合物，都進(jìn)行了覆蓋，預(yù)計(jì)到2029年到期，到期之前專li保護(hù)難以撼動。

069核心專li內(nèi)容：

包含一種或多種活性劑或治療劑的新型穩(wěn)定脂質(zhì)顆粒、制備脂質(zhì)顆粒的方法和遞送和/或施用脂質(zhì)顆粒的方法；更具體地，包含核酸(例如一種或多種干擾RNA)的穩(wěn)定核酸-脂質(zhì)顆粒(SNALP)、制備SNALP的方法和遞送和/或施用SNALP的方法；一種核酸-脂質(zhì)顆粒，包括：

(a)核酸；

(b)占顆粒中總脂質(zhì)的50mol%至65mol%的陽離子脂質(zhì)；

(c)包含磷脂和膽固醇或其衍生物的混合物的非陽離子脂質(zhì)，其中磷脂占顆粒中存在的總脂質(zhì)的4mol%至10mol%，膽固醇或其衍生物占顆粒中存在的總脂質(zhì)的30mol%至40mol%；

(d)抑制顆粒聚集的綴合脂質(zhì)，其占顆粒中總脂質(zhì)的0.5mol%至2mol%

（三）脂質(zhì)包封過程所需原料

1、LNP遞送系統(tǒng)的關(guān)鍵原料:可離子化脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)、DSPC脂質(zhì)、膽固醇。

LNP直徑為80-100nm，每個脂質(zhì)納米粒含有約100個mRNA分子。以ModernamRNA-1273疫苗為例：脂質(zhì)壁由四種不同的化合物組成，

1）SM-102——專有陽離子脂質(zhì)，是構(gòu)成納米顆粒壁的基本結(jié)構(gòu)

2）DSPC——磷脂酰膽堿，助力納米顆粒的壁結(jié)構(gòu)

3）膽固醇——膽固醇存在于人體所有的細(xì)胞膜中，根據(jù)溫度的不同，膽固醇有助于增加細(xì)胞膜的流動性或硬度，加入膽固醇能提高納米顆粒的穩(wěn)定性。

4）PEG-2000DMG——一種融于聚乙二醇的脂質(zhì)，能幫助納米顆粒的形成。

專有陽離子脂質(zhì)ALC-0315（輝瑞）和SM-102（Moderna）這兩種脂質(zhì)都是叔胺，在低pH值下質(zhì)子化（因此帶正電），在mRNA傳遞后實(shí)現(xiàn)安全清除。PEG脂質(zhì)都是PEG-2000結(jié)合物。

LNP和mRNA的顆粒是通過自組裝形成，通過兩種液體按照適當(dāng)?shù)牡牧魉俸团浔刃纬?。基本原理?/span>T型管一端是RNA的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過兩相的快速混合，從而讓LNP完成自主裝，需要控制水相和乙醇相的流速比，設(shè)計(jì)管道的形狀。

 脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)在很大程度上取決于它們的制備方法。脂質(zhì)體可以是直徑20-100nm的單層（小的單層）囊泡（SUV），直徑為100-1000nm的大單層囊泡（LUV）-1000nm或直徑>1000nm的巨大單層囊泡（GUV）或直徑>500nm的多層囊泡（MLV）。藥物輸送系統(tǒng)主要使用SUV和小型MLV，而GUV主要用作細(xì)胞模型。粒徑是決定脂質(zhì)體藥物包封率和循環(huán)半衰期的一個關(guān)鍵參數(shù)，較小的脂質(zhì)體更有可能逃脫吞噬細(xì)胞的攝取。

脂質(zhì)納米顆粒生產(chǎn)過程：LNP是在低pH（pH4.0）下制備的，此時可電離脂質(zhì)帶正電荷，因此它很容易與每個脂質(zhì)納米粒約100個mRNA分子形成復(fù)合物。微流控裝置用于將水中含有mRNA的流與乙醇中含有脂質(zhì)混合物的流混合。當(dāng)快速混合時，這兩種流的成分形成納米粒，將帶負(fù)電的mRNA包埋。

如何組裝LNP是mRNA疫苗生產(chǎn)最大的Know-how，需要控制LNP的組分、粒度、流量、流體形態(tài)等參數(shù)，來完成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的納米微粒組裝。目前從微流控到T型混合裝置核心技術(shù)掌握在極少數(shù)企業(yè)手中。

BioNTech/Pfizer xin冠疫苗的納米脂質(zhì)體顆粒（LNPs）生產(chǎn)采用沖擊式射流混合法，，采用高壓泵，讓mRNA溶液和脂質(zhì)體溶液形成兩股射流，在一個腔體中進(jìn)行對沖，從而產(chǎn)生劇烈的湍流。這種湍流能讓LNP各個組分充分地混合，從而形成包裹mRNA的納米脂質(zhì)體。

采用德國Knauer研發(fā)生產(chǎn)的IJM（碰撞噴射混合器）。規(guī)模化生產(chǎn)的沖擊式射流混合器結(jié)構(gòu)和參數(shù)是根據(jù)Moerna、BioNTech等企業(yè)需求量身定制。